(PCR (Polymerase Chain Reaction

تکنیکی است که به طور گسترده ای در بیولوژی مولکولی به کار برده می شود. این تکنیک نام خود را از یکی از ترکیبات کلیدی خود، DNA پلیمراز ، که جهت تهیه تعداد بسیار زیادی از کپی از یک رشته DNA مورد نظر بکار گرفته می شود؛ می گیرد. با ادامه روند PCR از تعداد کپی های اولیه یک قطعه DNA، که ممکن است تعداد بسیار کمی باشند، به عنوان الگو استفاده شده و به میزان بسیار زیادی در حد چندین میلیون کپی تولید می گردد. که محصول نهایی PCR را به طور کلی Amplicon می گویند. که همان ماده تقویت شده است. امروزه روش ‏PCR‏ جایگاه بسیار مهمی را در جنبه‌های مختلف مهندسی ژنتیک، بیولوژی مولکولی، میکروب‌شناسی تشخیصی، تشخیص سرطان و بیماری‌های ژنتیک، تشخیص هویت، جرم شناسی (پزشکی قانونی جهت تشخیص منشأ نمونه اسپرم، خون) وتعیین ترادف، باستان‌شناسی، مطالعات تکاملی موجودات و ... پیدا کرده است.

 

 

 تاریخچه:

 این تکنیک در سال 1984 توسط   K. Mullis معرفی شده و بطور سریعی در اکثر آزمایشگاههای جهان جهت اهداف مختلف بکار گرفته می شود.

که برخی از آنها عبارتند از: کلونینگ DNA برای تعیین توالی (Sequencing)، فیلوژنی بر پایه DNA، بررسی های عملکردی ژنها، تشخیص های ارثی ، شناسایی و انگشت نگاری ژنتیکی و ردیابی و تشخیص بیماریهای عفونی. در سال 1993 مولیس بخاطر ابداع این روش، جایزه نوبل را دریافت نمود.

بطور کلی مراحل PCR به صورت زیر است:

1-  مرحله آغاز (Initialization step): این مرحله شامل گرم کردن مواد به درمای حدود 96-94 (یا 98 درجه زمانی که از پلیمراز فوق العاده مقاوم به حرارت استفاده می شود) است که معمولا 9-1 دقیقه بطول می انجامد. البته این مرحله در مواردی بکار می رود که پلیمراز مورد استفاده جهت انجام فعالیت نیازبه گرم شدن دارد که به Hot- start PCR معروف است.

2-  مرحله دناتوراسیون( Denaturation Step): این مرحله اولین مرحله معمول PCR  بوده و شامل گرم کردن محیط به میزان 98-94 درجه به مدت 30-20 ثانیه است. این عمل باعث ذوب شدن DNA (جدا شدن دو رشته DNA از همدیگر) هم DNA الگو و هم DNA پرایمر از طریق از بین رفتن باندهای هیدروژنی بین نوکلئوتیدهای دورشته DNA و تولید DNAتک رشته ای است.

3-  مرحله اتصال (Annealing step): در این مرحله درمای واکنش به 65-50 درجه به مدت 40-20 ثانیه کاهش می یابد تا امکان اتصال DNA پلیمراز و پرایمر به DNAالگو که حالا تک رشته ای است فراهم آورد. بطور تیپیک درجه حرارت اتصل حدود 5-3 درجه کمتر درجه حرارت ذوب شدن پرایمر انتخاب می شود. مناسب ترین اتصال DNA-DNA بین رشته الگو و پرایمر زمانی ایجاد می گردد که هر دورشته در فاصله نزدیکی از هم قرار گیرند و هرچه توالی پرایمر با توالی رشته الگوی متناسب تر باشد این اتصال قوی تر بوده و اتصال قوی جهت انجام عمل پلیمراز مورد نیاز است. (نرم افزار  blast برای طراحی پرایمر استفاده می شود).

4-   مرحله گسترش یا طویل شدن (Extension/Elongation step): درجه حرارت این مرحله به آنزیم پلیمراز مورد استفاده و درجه حرارت اپتیمم مورد نیاز برای آن بستگی دارد. بطور مثال آنزیم Taqپلیمراز در درجه حرارت 80-75 درجه سانتیگراد فعالیت قابل قبول داشته  ولی بطور معمول از درجه حرارت 72 درجه سانتیگراد برای این آنزیم استفاده می شود. در این مرحله پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را بر اساس رشته الگو از 5’-3’ در کنار هم قرار داده و در نهایت رشته مکمل رشته الگوی اولیه را تولید می کند.  مدت زمان این مرحله به پلیمراز و طول رشته DNA الگو بستگی دارد. به عنوان یک قانون در درجه حرارت اپتیمم پلیمراز بایستی 1000 نوکلئوتید در دقیقه را پلیمریزه نماید. در شرایط مساعد برای مثال اگر محدودیت سوبسترا وجود نداشته باشد در هر مرحله گسترش DNA دوبرابر می شود.

5-  طویل شدن نهایی( Final Elongation): این مرحله فقط یکبار و پس از آخرین سیکل PCR و در دمای 74-70 درجه بمدت 15-5 دقیقه صورت میگیرد جهت اطمینان از تبدیل کلیه DNAهای تک رشته ای به دورشته ای انجام می گیرد.

6-   مرحله نهایی (Final Hold): این مرحله در 15-4 درجه سانتیگراد جهت نگه داری کوتاه مدت محصولات واکنش تا زمان استخراج انجام می گیرد.

 جهت اطمینان از اینکه محصول PCR همان توالی مد نظر بوده از الکتروفورز برروی ژل استفاده می شود. در این روش جهت مشخص کردن قطعه DNA با وزن مولکولی مشخص و مورد نظر از DNA Ladder استفاده می شود و قطعه مورد نظر در الکتروفورز از روی اندازه مولکولی استاندارد و کنترل مثبت مشخص می گردد. در روش Real-Time PCR  نیاز به الکتروفروز بعد PCR نیست.

 

انواع تکنیکهای PCR:

این تکنیکها از طریق ایجاد تغییرات مختصری در تکنیک PCR اولیه برای مثال ایجاد تغییرات در نحوه بکارگیری پرایمرها و... ایجاد و ابداع شده و جهت اهداف خاصی برنامه ریزی و اختصاصی شده اند .

1-      Allele-specific PCR

2-      Assembly PCR یا PCA (Polymerase Cycling) Assembly

3-      PCR نامتقارن (Asymetric PCR)

4-      Helicase - Dependent amplification 

5-      Hot-start PCR

6-      Inter sequence  specific PCR ISSR 

7-      Inverse PCR

8-      Ligation-mediated PCR

9-      (Methylation - specific PCR (MSP

10-    MiniPrimer PCR

11-     Multiplex PCR   

12-    Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification MLPA

13-    Nasted PCR

14-    Overlap Extension PCR

15-    ( Quantitative PCR (Q-PCR

16-    Reverse Transcription PCR

17-    Solid Phase PCR 

18-    ( Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL PCR

19-    PAN-AC

20-    Touch Down PCR

21-    Universal Fast Walking

22-    RFLP-PCR(PBR) 

23-    SSCP-PCR               

24-    SOEING 

 25-  RAPD-PCR یاArbitraily  primed - PCR

 26-   ARMS- PCR

27-    Real-Time-PCR                    

28-    BOOSTER-PCR            

29-    DAF-PCR  

30-    SCAR-PCR          

31-     AFLP    

32 -ALP,ST          

  

 (‏Multiplex- PCR‏)‏: یکی از روش‌های تغییریافته ‏PCR‏ است که در آن تنها یک جایگاه ژنی مورد بررسی قرار می‌گیرد، با استفاده از پرایمرهای مختلف می‌توان چندین جایگاه را مورد بررسی قرار داد و از چندین جفت پرایمر اختصاصی جهت تکثیر استفاده می‌شود. کاربردهای این روش می‌تواند شامل موارد زیر باشد: ‏

1-  بخش‌های بزرگی از یک ‏DNA‏ (هدف)، جهت جست‌وجوی تغییرات می‌تواند بررسی شود. برای مثال کشف نقص‌ها در بیماری دیستروفی عضلانی روشن یا کشف بخش‌های مختلف ‏IS6110‎‏ و ‏IS986‎‏ در مایکروباکتریوم توبر کلوزیس عامل بیماری سل، ‏

‏2-  بخش‌های غیرمربوط به هم در ژنوم هدف می‌تواند مورد آزمایش واقع شود.‏

‏3-  می‌توان از طریق این روش با پرایمرهای مختلف به جست‌وجوی عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسایی عوامل شایع مننژیت. این روش بیشتر برای شناسایی جایگاه‌هایی از ژن‌ها به کار می‌رود که انواع زیادی از جهش در آنها به وقوع می‌پیوندد.‏

 

 (‏RT- PCR‏)‏: این روش به ‏PCR‏ نسخه‌برداری معکوس نیز معروف است که ماده اولیه در آن ‏RNA‏ است. اولین مرحله در این روش تبدیل ‏RNA‏ به ‏DNA‏ (‏ DNAای که مکمل توایس‌های ‏mRNA‏ است) توسط آنزیم نسخه‌بردار معکوس می باشد (RT). برخی از موجودات مانند برخی از ویروس‌های ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است. بعضی از ویروس‌ها مانند ویروس هپاتیت ‏B‏ هرگز به شکل ‏DNA‏ مابین در اثر آنزیم نسخه‌بردار معکوس درنمی‌آید. آنزیم نسخه‌بردار معکوس (‏RT‏) در این روش از  "‏Avian Myeloblastosis Virus (AMV)‎‏" و "‏Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV)‎‏ " به‌دست آمد.

کاربرد این آنزیم به‌دلیل آن‌که آنزیم به حرارت حساس بود در ابتدا پایین بود ولی با کشف باکتری به نام "ترموس ترموفیلوس" یک ‏DNA‏ پلیمر از مقاوم به نام )‏Tth‏( بهبود یافت که در حضور یون ‏Mn+2‎‏ دارای فعالیت نسخه‌برداری معکوس است و در دمای 72 درجه سانتیگراد توسط این آنزیم از روی ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته می‌شود و سپس ‏Mn+2‎‏ اضافی توسط اتیلن گلیکول تترااستیک اسدی )‏EGTA‏) حذف می‌شود و سپس این آنزیم از ‏DNAای که خود ساخته استفاده و آن را تکثیر می‌کند.‏

 

 (‏ARMS- PCR‏)‏ : این روش تکثیری قدرتمند برای مشخص کردن جهش‌های نقطه‌ای است. در این روش از پرایمرهای جهش یافته و طبیعی در دو لوله جداگانه استفاده می‌شود. اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر طبیعی انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است و اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله‌ حاوی پرایمر جهش یافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌ای در باز مورد نظر است. این روش نام‌های دیگری نیز دارد از جمله ‏MAMA-PCR‏ مخفف ‏Amplificatin Multation Assay‏ ‏Mismatch‏ و ‏COP-PCR‏ مخفف ‏Competitive Oligonucleotide Primming‏. ‏

 

 ‏Nested- PCR‏: در این روش از دو جفت پرایمر استفاده می‌شود، طوری که جفت دوم در بین جفت اول جای می‌گیرد. در این روش ابتدا پرایمر بیرونی توالی هدف در طول 30-15 چرخه تکثیر می‌شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله‌ای دیگر منتقل می‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرایمر داخلی مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف کوچکتری از ‏DNA‏ که درون ‏PCR‏ اولی است، به اندازه 40-15 چرخه تکثیر می‌شود.‏

مزایای این روش تغییر یافته ‏PCR‏ عبارت است از: 1- نیاز به پروب (کاوشگر) و تأییدهای بعدی کمتر است، 2- حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است 3- به دلیل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جدید، ممانعت کننده‌ها رقیق می‌شود. این روش در تعیین جنسیت جنین در سه ماهه اول بارداری استفاده شده و از این طریق توانسته‌اند بیماری‌های وابسته به جنس را تعیین کرده و از تولد کودکان بیمار جلوگیری کنند.‏

همچنین ویروس "سیتومگالوویدوس" که می‌تواند سبب ناشنوایی در 1% از کودکان شود، توسط این روش تشخیص داده شده و امکان درمان زودهنگام از این طریق امکان‌پذیر است. جنین‌های مبتلا به سندروم داون نیز در مرحله بارداری مادر با این روش تشخیص داده شدند.

 

‏Real-Time PCR‏: به علت ورود نسل جدیدی از ترموسایکلرها با سیستم فلورومتری که اجازه پایش پیوسته خاصیت فلوئورسانس محصول ‏PCR‏ در زمان جمع شدن را می‌دهد، این روش ابداع شد. در این روش از کاوشگرها یا پروب‌های هیبریداسیون نشان‌دار شده با رنگ‌های فلورسانس در انتهای 5 یا 3 استفاده می‌شود. که امکان پایش پیوسته محصول ‏PCR‏ را بدون جداسازی آنها در روش‌های الکتروفورز در ژل آگاروز یا ژل پلی آکریل آمید می‌دهد. این سیستم در سال 1992 کشف شد. این روش به دلیل کاهش زمان سیلک‌های ‏PCR، حذف مرحله ‏Post-PCR‏ و کاربرد نشانگرهای فلوروژنیک و روش‌های حساس آشکارسازی تابش آنها باعث افزایش سرعت این سیستم نسبت به سیستم ‏PCR‏ معمولی شده است. سازندگان و کاربران این روش سعی می‌کنند محصول ‏PCR‏ کوچک‌تر طراحی کنند تا سرعت افزایش یابد اما تجربه نشان داده که کاهش اندازه محصول لزوماً بازده ‏PCR‏ را بهینه نمی‌کند. البته این روش دارای معایبی نیز است از جمله می‌توان به عدم ناتوانی در مشخص کردن اندازه محصول بدون باز کردن سیستم و ناسازگار بودن برخی پلت فرم‌ها با شیمی برخی رنگ‌های فلورژنیک اشاره کرد. برای شناسایی بسیاری از ویروس‌های عامل بیماری‌های انسان از این روش استفاده شده است.

 ‏

Touch down PCR :  در این روش دمای آنیلینگ ازدمای بالاتر از Tm  بندرت کاهش می یابد وموجب کاهش  محصول کاذب و پرایمر دایمر می شود.

 

Long distance PCR  : با این روش قطعات ببیش از 20 kb همانند سازی میشوند. برای انجام این نوع PCR باید DNA  ژنومی از کیفیت بالایی برخوردار باشدو پرایمر ها  به دقت طراحی شوند. برای اینکاراز klon taq استفاده میشود.این آنزیم نسخه ای از DNA poly  است که قسمت N ترمینال آن حذف شده است و با pfu poly به نسبت 180 به 1 مخلوط میشود و فاقد 5` اگزو نوکلئازی است.

 

Hot start PCR  : عبارت است از جدا کردن یک یا چند ترکیب مهم PCR  ( ترجیحا" انزیم پلیمراز) بطوریکه بلا فاصله بعد ار دناتوراسیون DNA هدف به واکنش اضافه میشوند  ( استفاده از , PCR gem  و آنتی بادی آنزیم پلیمراز )

- Hot start  به کمک آنتی بادی : مونوکلونال آنتی بادی ضد آنزیم پلیمراز را به واکنش اضافه میکنند درنتیجه  فعالیت پلیمرازی آنزیم را مهار میکند. هنگامیکه دمای واکنش به 94 درجه می رسد آتی بادی دناتوره می شود و دو باره  پلیمراز فعال می شود.

 - Hot start  به کمک Ampliwax : به دیواره لوله های محصوص اینکاربه نوعی واکس آغشته است که بعد از مختصری گرم کردن ذوب شده و روی ئاکنش را میپوشاند .  آنزیم پلیمراز را روی واکس قرار میدهند . در دمای 94 درجه این واکس بخار میشود و آنزیم پلیمراز با واکنش تماس پیدا می کند.

PCR  با پرایمر های احتمالی   (Degeneracy  primer):

 این پرایمر ها بر اساس اطلاعات ترادف پروتئین یک ژن طراحی میشوند و بر اساس اسید های آمینه ای انجام میگیرد که دارای یک یا دو کدون باشند. پرایمر هایRAPD    - بنام پرایمر های اختیاری هم گفته میشوند . این پرایمر ها پلی مرفیسم را بدون شناخت توالی نوکلئوتیدی ردیابی می کنند .

 

 RFLP-PCR : در این روش ابتدا قطعه حاوی جایگاه چند شکلی را با واکنش زنجیره پلی مراز و استفاده از دو پرایمر مخصوص که به همین منظور طراحی شده تکثیر می نمایند و پس از هضم آنزیمی ، الکتروفورز می کنند . در PBR جهش هایی از نوع نقطه ای و حذف و اضافه که باعث تغییر در سطح قطعه آنزیمی می گردند قابل تشخیص است . در PBR تنوع در داخل منطقه ای که از دو طرف به پرایمر ختم شده تعیین می نمود که این ناحیه معمولا kb 5/0 است . ضمنا در PBR مزایایی چون سادگی ؛ سرعت زیاد ، عدم نیاز به مواد رادیواکتیو و تکرارپذیری بالا مطرح می باشد .

 

SSCP-PCR :زمانیکه DNA دو رشته ای در روی ژل الکتروفورز حرکت داده می شود ، حرکت DNA به اندازه قطعه بستگی دارد به طوریکه مولکولهای کوچک از منافذ ژل به آسانی عبور می کنند . در الکتروفورز SSCP ابتدا از یک ماده دناتوره کننده مانند اوره برای تبدیل DNA ود رشته ای به تک رشته ای استفاده می شود . در هنگام راندن DNA تک رشته در ژل اثر متقابل داخل مولکولی روی می دهد به عبارت دیگر DNA تک رشته قادر است در بخش هایی یا خود باند تشکیل دهد بنابراین حرکت مولکولها در این حالت بیشتر به ساختار مولکول DNA تک رشته نیز وابسته است ( ساختمان سرم )

ساختمان سوم در قطعه تک رشته وابسته به توالی کل قطعه است اگر جهش در توالی DNA رخ دهد ساختار قطعه تغییر می یابد و سرعت حرکت آن متفاوت از نوع وحشی است ، بنابراین قابل شناسایی است .

اگر پلی مورفیسم در قسم آغازین محصول PCR باشد شناسایی آن با SSCP بسیار راحت تر است .

 

DGGE- PCR: یکی از روش های مناسب برای آشکار سازی جهش ها است . این روس بر روی فرآورده های PCR صورت می گیرد در صورتیکه قطعات رشته DNA در یک نوکلئوتید با هم متفاوت باشند ، الگوی واسرتست شده متفاوتی را نشان می دهند . در این روش دو نمونه DNA دردو ستون جداگانه از یک ژل پل اکریلامید که دارای نسبتی از غلظت ماده و اسرتست کننده ( معمولا فرمامید ) است مورلاالکتروفورز قرار می گیرد . وقتی مولکولها به سطح بخرانی دناتوره می رسند دو رشته DNA شروع به جدا شدن می کنند . در این حالت کاهش معنی داری در حرکت قطعات ایجاد می شود . این نقطه به عنوان نقطه ذوب عمل می کند و باعث تاخیر در حرکت مولکلول DNA جهش یافته نسبت به فرم وحشی می گردد.

DGGE به موارد رادیواکتیو و مواد  شیمیایی سمی احتیاج ندارد ولی ابزار پیشرفته می خواهد . درصد تعیین موتاسوین در این روش خیلی نزدیک به 100 % است . نوع مقابله ای از این روش TGGE می باشد که در آن از حرارت به جای غلظت مواد شیمیایی در ژل استفاده می شود . بهترین طول قطعات برای DGGE بین bp 1500-150 می باشد . برای واسرتست شدن کامل قطعات حاصل از زنجیره پلی مراز از یک ناحیه بالاترین دمای ذوب مصنوعی GC-clamp استفاده می شود.