آنزیمها ی مورد استفاده درمهندسی ژنتیک 

آنزیم هاابزار کار مهندسی ژنتیک در آزمایشگاه میباشند و مخقق بدون آنها نمیتواند کاری انجام دهد. در این درس با انواع آنزیمها و طرز کار آنها آشناشده و مورد استفاده هر کدام را بررسی میکنیم.

الف )  لیگازها :

این آنزیمها اتصال فسفو دی استر بین تک رشته ها را روی رشته  DNA  تک رشته ای بر قرار میکند. 5`-p  یک رشته به 3`-OH   رشته دیگر متصل  میشود.. کو فاکتور آنها ATP یا NAD است .

1-  آنزیم  DNA ligase : این آنزیم  از باکتری E.coli   استخراج می شود وکوفاکتور آن NAD است و اکثرا" اتصال  بین دو DNA که  برش انتهایی ا نها بصورت  Cohesive  باشد  را بر قرار میکند و عده ای معتقدند که این آنزیم در فر قرار کردن اتصال بین دو  DNA  که  برش انتهایی آنها بصورت blunt   باشد مشکل خواهد داشت .

 2- آنزیم  T4 DNA ligase : این آنزیم از فاژ T4  استخراج میشود وکوفاکتور آن ATP است . این آنزیم  اتصال هر دو انتهای Cohesive  و blunt  را بر قرارمیکند.

 3- آنزیم  T4 RNA ligase : این آنزیم اتصال فسفو دی استربین 3`- OH  و  5`-P  مولکولهای RNA  را بر قرار میکند . کوفاکتور آن ATP و Mg2+ است

ب)  نوکلئاز ها :

این آنزیم ها  نوکلئو تید هار ا تجزیه میکنند.

4- آنزیم  DNase I  : یک اندو نوکلئاز است و dsDNA را به روش غیر اختصاصی تجزیه میکند . کوفاکتور آن  Mg2+ ، +  Ca2  و Mn2+  است .. این آنزیم برای مقا صد زیر استفاده میشود:

- تجزیه غیر اختصاصی DNA 

-  نشاندار کردن DNA

- ایجاد موتاسیون در ژن

5-   نوکلئاز استافیلوکوکی : DNA  و RNA  را به روش غیر اختصاصی تجزیه میکند.

6- انزیم   RNase A-  این آنزیم RNA  تک رشته ای را هیدرولیز میکند.

 7- آنزیم RNase H - این آنزیم RNA  را که با DNA دوبلکس  شده باشد  راهیدرولیزمیکند و در سنتز   رشته  دوم cDNA  کاربرد دارد.

8-  آنزیم  S1 Nuclease  : این آنزیم پلی نوکلئو تید تک رشته ای را هیدرولیز میکند.

 

 

9- آنزیم  Mong bean Nuclease – این آنزیم شبیه  S1 Nuclease  عمل میکند

10- آنزیم  Exonuclease III    (گزو نوکلئاز :  (3`→ 5   فعالیت 3`  فسفاتاز دارد

همچنین فعالیت شبیه RNase H  هم دارددارد.

این آنزیم اتصال فسفودی استرجایگاههای آپورینی یا آپیریمیدینی را تجزیه میکند

11- آنزیم  Bal1 Nuclease : این آنزیم ssDNA  را به روش اگزو نوکلئازی یا اندو نوکلئازی تجزیه میکند

ج ) آنزیم های محدود گر

د)  متیلازها

12-  فسفاتازها :  این آنزیمها فسفومونواسترازغیراختصاصی هستندکه درpH قلیایی فعالیت میکنند و درحضور پذیرنده های فسفات مانند اتانل آمین و Tris  بعنوان فسفو ترانسفراز عمل میکتتد .

فسفاتاز اتصال P--O را تجزیه میکند ولی فسفوریلاز اتصال C--O را تجزیه میکند

کاربرد فسفاتاز ها :

دفسفریلاسیون انتهای فسفات اسید نوکلئیک 

وقتی با پروتئین یا اسید نوکلئیک کنژوگه شوند بعنوان آنزیم رپورتر عمل  میکند

 بعنوان leader  در ترشح خارج سلولی و پروتئین های فیوژن عمل میکند

13-  آنزیمهای T4 poly Nucleotid Kinase    : این آنزیمها فسفات γ را از NTP به مولکول پذیرنده (Aceptor)  انتقال میدهد و عبا رتند از:

پروتئین کیناز ها

 کربو هیدرات کینازها

پلی نوکلئو تید کینازها

آنزیم T4 poly nuleotide kinase برای فسفریله کردن یا نشاندار کردن 5`- OH استفاده میشود ، همچنین برای اندازه گیری فعالیت اندونوکلئازی بکار میرود.

ه ) DNA پلیمرازها : گروهی از آنزیمها هستند  هستند که بکمک چهار نوکلئوتید تری فسفات  (dNTP) از روی رشته الگو یک رشته DNA  سنتز میکنند.  این آنزیمها برای فعالیت خود احتیاج به پرایمر دارند. چنانچه دارای فعالیت   3→ 5`` اگزونوکلئازی  باشند کار  غلط گیری ( proof reading )   را هم انجام میدهند

14- آنزیم DNA polymerase I  :

  این آنزیم دارای فعالیت های زیر است :

 فعالیت 3→ 5``   اگرونوکلئازی

فعالیت  5`→ 3`   DNA پلیمرازی

فعالیت RNase H

فعالیت نوکلئازی

این آنزیم برای کارهای زیر استفاده میشود :

DNA LabelingNick  translation

ایجاد انتهاهای Blunt

15- آنزیم T4 DNA plymerase: یک آنزیم مولتی فانکشنال است وبرای کارهای زیراستفاده میشود.

 دارای فعالیت DNA  پلیمرازل

 فعالیت  3→ 5``   اگرونوکلئازی

برای PCR   هم قابل استفاده است و در 37 درجه فعالیت میکند

برای ایجاد انتهاهای Blunt  در dsDNA  استفاده میشود

فعالیت 5`    نوکلئازی ندارد

16- آنزیم T7 DNA plymerase: این آنزیم دارای  فعالیت 3→ 5``   اگرونوکلئازی میباشد

Sequenase نسخه ای از این آنزیم است که فاقد فعالیت 3→ 5``   اگرونوکلئازی میباشد وبرای Sequencing استفاده میشود

سرعت پلیمریزاسیون این آنزیم زیاد است و برای سنتز رشته موتاژن در موتاژنزیس بکار میرود

انتهای 5`overhang را پر میکند

17-  آنزیم Taq DNA polymerase  : این آنزیم از باکتری گرمادوست ترموس اکواتیکوس استخراج میشود

 فعالیت 3→ 5 اگزو نوکلئازی ندارد

فعالیت 5`  نوکلئازی دارد

فعالیت ترمینال ترانسفرازی دارد

آنزیمهای  نسخه بردار معکوس () :  گروهی از DNA polymerase  ها بنام    RNA - dependent DNA polymerase یا Reverse Transcriptase گفته میشوند  این آنزیمها  RNA  را الگو قرار داده و  DNA  مکمل آن را سنتز میکند و عبارتند از:

  18 - آنزیمAvian Myeloblastosis Virus ) AMV)  : این آنزیم از نوعی ویروس استخراج میشود که در پرندگان بیماری ایجاد میکند .

 این آنزیم فعالیت RNase H  هم دارد و برای سنتز رشته دوم cDNA  استفاده میشود

19- آنزیم  Molony Murine Leukemia Virus ) MLMV)  : این آنزیم از نوعی ویروس استخراج میشود که در جوندگان بیماری ایجاد میکند.

آین آنزیم   فعالیت RNase H   کمتری  از آنزیم AMV دارد .

 

20 – آنزیم  ترمینال ترانسفراز :

 این آنزیم پلیمریزاسیون dNTP هارا ازروی پایه  3`- OH انجام میدهد . این آنزیم برای اتصال نوکلئوتید ها به انتهای 3`- OH رشته DNA استفاده میشود وبرای کلونینگ محصول PCR قابل استفاده است.

21- آ نزیم های RNA polymerase    :

این آنزیم ها اطلاعات ژنتیکی را از DNA  به RNA  منتقل میکنندو عبارتند از

RNA  پلیمراز باکتریایی

T7 RNA  پلیمراز  ، یک پروموتور قوی دارد

T3 RNA  پلیمراز

 SP6 RNA  پلیمراز

 22- آنزیم پلیمراز A: :

این آنزیم دم پلی A  را سنتز میکند ودر انتهای3`  رشته  mRNA  سلولهای یوکاریوت غیر هیستونی یافت میشود.

این آنزیم میتواند RNA های polyA   منفی را به polyA+  تبدیل کندو آنها را بکمک  oligo) dT) بعنوان پرایمر، به cDNA  تبدیل نماید

23-  آنزیم های رپورتر / مارکر:

 ابن آنزیمها در کلونینگ استفاده میشوند وچون سریعا" بیان میشوند برای غربالگری کلنی های باکتریایی مفید میباشند (  آنزیم بتا گالاکتوزید ازبرای غربالگری  توضیح داده میشود)

ß گالاکتوزیداز - اتصالات گالاکتوزیدی را در الیگو ساکارید ها هیدرولیز میکند

ß لاکتاماز - اتصالات آمیدی را در حلقه ß لاکتام هیدرولیز میکند و پنی سیلینوئیک اسید  و سفالوسپوروئیک اسید تولید میکنند که از نظر بیولوژیک غیر فعال هستند

-کلرامفنیکل استیل ترانسفراز ( CAT) - کلرامفیکل را غیر فعال میکنند

-لوسیفرازها - آنزیم های تولید کننده نور هستند.

 

 

آنزیم های ( برش دهنده) محدود گر  ((Restriction Enzymes

 

اندو نوکلئازهای محدود کننده گروهی از DNase  ها میباشند که توالی نوکلئو تیدی خاصی را شناسایی میکنند . این آنزیم ها  dsDNA  را بصورت اختصاصی یا غیر اختصاصی برش میدهند.  این آنزیم ها اولین بار در دهه 1950 به عنوان سیستم های Resriction وModification  ( باکتریها برای جلوگیری از حمله باکتریوفاژها و عناصر ژنتیک خارجی این سیستم ها را بکار می برند ) کشف شدند. باکتریها توسط سیستم R-M میتوانند DNA ای را که از خارج  هنگام عفونت ،کنژو گاسیون و ترانسفکشن وارد آنها میشود را تخریب کنند.سیستم R - M  باکتریایی  معادل  سیستم ایمنی   پروکاریوتی   میباشد.

سیستم های R-M که در میکرو ارگانیسمها ( باکتریها ) یافت میشوند بسیار گوناگون  میباشند (حتی در داخل یک سلول ) . تعداد این آنزیمها از 2100 فراتر رفته و 17 آنزیم نوع I ، 179  آنزیم نوع II و 4 آنزیم از نوع III وهمچنین مشخصات 190 متیل ترانسفراز تغییر دهند DNA تعیین و شناسایی شده است .

سیستم هایR-M   دو فعالیت آنزیمی دارند:

الف ) یک اندونوکلئاز  (R.ENase) با جایگاه اختصاصی که مسئول هضم DNA خارجی میباشد

ب) یک متیلاز تغییر دهنده DNA ( متیل ترانسفراز ) که همان توالی ویژه را شناسایی میکند .  متیل ترانسفراز ( M.MTase) مسئول تغییر دادن وحفظDNA  خودی  از هضم شدن توسط  R.ENase میباشد. ممکن است فعالیت  R وM در یک آنزیم (واحد) که دارای چند زیر واحد است قرار داشته  و یا از نظر فیزیکی آنزیم های جداگانه  باشند. علی رغم اینکه آنزیم های Restriction   و   Cognate Modifications  سکانس مشابه را شناسایی میکنند، ترادف اسید آمینه آنها یکسان نیست، شاید این آنزیم ها با مکانیسم متفاوت DNA  هدف را شناسایی میکنند .

 

انواع سیستم های آنزیمی  Restriction - Modification

بر اساس ترکیب آنزیم ، کوفاکتورهای مورد نیاز ، قرینگی توالی DNA  ای که شناسایی میکنند و مشخصات هضم DNA   به چهار نوع تقسیم میشوند. لازم به ذکر است که گروه متیل دهنده  سوبسترا در تمام متیل ترانسفرازها AdoMet میباشد.

آنزیم های  R-M نوع   I:

 مجموعه چند آنزیمی متشکل از زیر واحد های غیر همسان بنام  R,M و S میباشند. زیر واحد S اختصاصیت را برای MوR تعیین میکند. کوفاکتور های این آنزیمها  ATP وMg2+   میباشند و DNA  ای که تغییری  در آن ایجاد نشده باشد را در محلی دور از جایگاه شناسایی و تا اندازه ای بصورت احتمالی ( Random ) برش میدهند . هیدرو لیز ATP قسمتی از فعالیت Restriction   این آنزیم ها میباشد  و بطریق رقابتی با فعالیت اندون.کلئازی    خودش جایگاه اختصاصی DNA   هدف را متیله میکنند.

آنزیم های R-m  نوع II  :

این آنزیمها دارای   فعالیت  R.ENase  و M.MTase  جداگانه میباشند . R.ENase  ها دایمر بوده و زیر واحد های آنها همسان است در صورتیکه M.MTase  ها آنزیم های مونومر میباشند . R.ENase  های نوع II برای فعالیت خود فقط  Mg2+  نیاز دارند.

R.ENase  ها و M.MTase  ها توالیهای  اختصاصی نوکلئوتیدی مشابه را شناسایی میکنند . اکثر R.ENase  های نوع دوم  DNA  را ازمحل جایگاه شناسایی برش میدهند ولی  تعدادکمی از آنها که نوع IIS گفته میشوند DNA  را در فاصله معینی  از جایگاه شناسایی برش میدهند .

آنزیم های R-M نوع III:

 این آنزیم ها متشکل از دو زیر واحد غیر همسان میباشند که برای فعالیت رستریکشن به   ATPو  Mg2+  نیاز دارند. این آنزیم هاتوالی های کوتاه غیر پالیندرم را شناسایی کرده و DNA  را از محلهای معین (درصورتیکه درجایگاه شناسایی  تغییری ایجادنشده باشد )برش میدهند این آنزیمها ATP  را هیدرولیز نمیکنند و برای برش دادن DNA  به AdoMet   ( S-adenosylmethionine)نیاز ندارند اما AdoMet  موجب تحریک فعالیت اندو نوکلئازی آنهامیشود.

آنزیم های نوع  IV :

این آنزیمها از نظر تکاملی بین آنزیم های نوع  IIوIII میباشند. این آنزیمها (مانند Eco571) متشکل از R.ENae  و M.MTase  جدا گانه میباشند اما R.ENase  که یک آنزیم مونومر میباشد  فعالیت متیلازهم  دارد. این فعالیت متیلازی قدرت کافی ندارد تا DNA  میزبان را در In vivo محافظت کند.R.ENase  و M.MTase  توالی های ناقرینه را شناسایی میکنند . R.ENase  در حضور Mg2+  در فاصله معینی  از جایگاه شناسایی,   DNA  هدف را برش میدهد ( مثلا" Eco571 بفاصله 14/16 نوکلئو تید از محل شناسایی این کار را انجام  میدهد ) . فعالیت Restriction  آنها توسط AdoMet تحریک میشود.

 

 

 

سیستم های Modification یا Restriction  مستقل

علاوه بر چهار سیستم آنزیمی که بحث شد ، بعضی از باکتریها سیستم های دیگری مانند سیستم R  مستقل از M و سیستم M  مستقل از R  دارند. یک مقوله ای از سیستم های R-M  که در تکنولوژی نو ترکیب اهمیت بخصوصی  دارد  Restriction  وابسته به Methylation )    MDRS)  میباشد که R.ENase   ترجیحا" DNA  را در جایگاههای متیله برش میدهد . MDRS  متشکل از فرآورده های ژنی است که  به چندین جایگاه مستقل در ژنوم E.coli K12 مانند mcrA , mcrB    و mrr متصل میباشند.

 

جدول شماره 5- طبقه بندی سیستم های R-M

Feature

نوع I

نوع II

پروتو تایپ                   نوع IIS

نوع III

نوع IV

ساختمان فعال R-M

یک آنزیم با سه زیر واحد (R.M.S)

انزیم های جدا گانه

R دایمر                        R مونومر

M مونومر                     M مونومر

یک آنزیم با دو زیر واحد

آنزیم عای مونومری جدا گانه

کوفاکتورها

ATP و mg 2+

mg 2+

ATP و mg 2+

(AdoMet) mg 2+

جایگاه شناسایی

غیر قرینه

پالیندرم                  غیر قرینهه

عیر قرینه

غیر قرینه

هضم DNA

فاصله متغیر از هر طرف

همان جایگاه به فاصله معینی  از طره 3`

25-27bp از طرف 3`

14bp از طرف3`

متیلاسیون

دو رشته را بوسیله M  متیله میکند

دو رشته             یک متیل ترانسفراز روی هر رشته

فقط یک رشته

دو رشته

 

 

 

 

سیستم های آنزیمی  R-M نوع II:

 آنزیم های محدودکننده ،  مخصوصا" نوع II توالی نوکلئو تیدی منحصر بفرد را شناسایی میکنند. دقت در انتخاب توالی نوکلئو تیدی خاص ، تنوع توا لی  جایگاه شناسایی و آسانی نسبی کنترل Restriction  با استفاده از  M.MTase   ، آنزیم های نوع II  را وسیله ای ضروری برای  دستکاری DNA  نموده  است . بعلاوه توسعه DNA  نوترکیب نتیجه کشف آنزیم های با جایگاه اختصاصی میباشد.

تا کنون ژن حدودصدسیستم R-M کلون شده وتعیین مشخصات شده اند.  ژن سیستم های R-M از نظر سازمان، Orientation  و اندازه هتروژن هستند . کلونینگ ژنهای آنها خالص سازی آنزیم را آسان تر کرده  و آنزیم  با خلوص  بالاتر تهیه میشود . بنا بر این با قیمت کمتر برای  استفاده  وسیع تر در دسترس  قرار دارند .  این کشف موجب شد  تا جزئیات مکانیسم واکنش و بر خورد  DNA -protein   در سطح مولکولی مطالعه شود. اغلب R.ENase  ها بصورت تجارتی در دسترس قرار دارند و برای ایجاد قطعات DNA برای کلون کردن ژن ، تعیین نقشه DNA  و کروموزوم ، DNA Sequencing   و هیبریداسیون بطور گسترده استفاده میشودارند.

 

نامگذاری آنزیمهای R-M

1-   سه حرف  اول ( ایتالیک ) جنس ( اولین حرف جنس باکتری ) و گونه ( دومین و سومین حرف )  ارگانیسم منبع را بیان میکند.  مانند Eco برای E.coli  و Hin  برای هموفیلوس آنفلوآنزا .

2- بعد از  سه حرف مذکور حرف اول  سویه یا گونه  بصورت  غیر ایتالیک و یا اعداد عربی می آید مانند:  EcoK بری Ecoli   سویه K  ،   Hind  برای H.influenza   سویه d  یا Sau 3A  برای استافیلوکوک اورئوس 3A  . عناصر خارج کروموزومی مانند ویروس یا پلاسمید به همین صورت  متعاقب اسم مذکور آورده میشود مانند: EcoRI و EcoPI.

3-  متعاقب آن بدون در نظر گرفتن فاصله ، اعداد رومانی (I,II,III,.....) برای تعیین آنزیم های مختلف که توسط همان سویه تولید میشوند مانند HindII و HindIII .

4-  برای اختصاصی کردن R.ENase  یا M.MTase  حروف بزرگ R و M در جلو نشانه آنزیم قرار میگیرد و با یک نقطه از آن فاصله  میگیرد مانند : R.EcoRI  و M.EcoRI.