کلونینگ ( Cloning )

 

برای اتصال دو DNA به یکدیگر در آزمایشگاه از آنزیم  DNA ligase  استفاده میشود DNA ligase  آنزیمی است که بین دو نوکلئوتید  اتصال  فسفودی استر ایجاد میکند. دو نوع DNA ligase  وجود دارد یکی T4 DNA ligase  که از فاژ T4  استخراج میشود  وانرژی لازم برای فعالیت خود را از  ATP تامین میکند این آنزیم دوانتهای blunt  وهمچنین دوانتهای  Cohesive را بهم متصل کند( اتصال فسفودی استر ایجاد میکند). دیگری  DNA ligase  باکتری E.coli  که انرژی لازم برای فعالیت خودراازNAD بدست می آورد  و بیشتر برای اتصال انتهاهای Cohesive  استفاده میشود.

عمل Ligation  طی سه مرحله انجام میگیرد :

در مرحله اول گروه آدنیلیل از ATP ) NAD ) به آنزیم متصل میشود و زنجیره جانبی NH2 اسید آمینه لیزین آدنیله میشودو پیرو فسفات (با آنزیم T4 DNA ligase ) یا نیکو تینامید (با آنزیم E.coli DNA ligase  ) آزاد میشود.

در مرحله دوم گروه آدنیلیل به  انتهای  5`-P  متصل میشود . در مرحله سوم اتصال فسفو دی استر بین گروه هیدروکسیل 3`- OH و گروه فسفوریل آدنیله شده 5` برقرار میشودوAMP آزاد میگردد.

 

 

 

شکل 5- طرز عمل DNA ligase  این آنزیم نوکلئوتید ها را از انتهاهای 3`-OH و  5`-P بهم متصل میکند. آنزیم لیگاز توسط NAD ( باکتری ) یا ATP( فاژT4) آدنیله میشود.  آنزیم انتهای5`-P را در محل شکاف آدنیله میکندو اتصال فسفودی استر تولید میشود.( Rریبوز و A آدنین)

 

انجام واکنش Ligation:

1-  مقدار insert  و vector را تخمین برنید ( برای انجام واکنش مولاریته insert  را سه برابر vector  در نظر بگیرید )

2-  حجم واکنش را در نظر بگیرید ( بهتر است یک میکروگرم DNA  را درواکنشی به حجم 20-30 میکرولیتر انجام گیرد )

3-  با آب  دوبار تقطیر استریل حجم واکنش را تنظیم کنید

4- واکنش را مدت 5 دقیقه در 45 درجه قرار دهیدتا انتهاهای Cohesive کاملا" Relax شوند

5-  بافر Ligation را با غلظت نهایی 1x استفاده کنید

6-  یک میکرولیتر آنزیم T4 DNA ligase  به واکنش اضافه کنید

7-  چند ثانیه آن را spin  کنید

8- مدت 3-2 ساعت در دمای 37 درجه قرار دهیدو سپس واکنش را ترانسفرم کنید.

 

18- پیدا کردن کلنی های حاوی Recombinant DNA:

در این کارگاه آموزشی از دو روش استفاده میکنیم

الف )  غیر فعال کردن  ژن مقاومت به تتراسیکلین پلاسمید pBR322

جایگاه آنزیم BamHI روی سکانس ژن مقاومت به تتراسیکلین پلاسمید pBR322 قرار دارد چنانچه   DNA خارجی در جایگاه این آنزیم کلون  شود و پلاسمید نو ترکیب در باکتری ترانسفرم گردد ، باکتری نسبت به تتراسیکلین حساس میشود.Insert DNA   مورد استفاده که قطعه ای از DNA میتوکندری (kDNA) انگل لیشمانیا میباشد در حدود 800bp  است که آن را در جایگاه BamHI  پلاسمید pBR322 کلون میکنیم

1-  محصول Ligation  را درباکتری HB101 ترانسفرم کنید ( باکتری XL1-blue نسبت به تتراسیکلین مقاوم است و برای این آزمایش قابل استفاده نمیباشد).

2-  محصول ترانسفرم شده را روی پلیت آگار حاوی آمپی سیلین و بدون تتراسیکلین پخش کنید.

3- روز بعد یک Master plate  حاوی آمپی سیلین و بدون تتراسیکلین تهیه کنید و آن را شطرنجی نموده و خانه های آن را شماره گذاری نمایید سپس کلنی  های  حاصل از ترانسفرماسیون شب قبل را داخل خانه های شطرنجی (شماره دار) پلیت منتقل کنید.

4-  روز بعدنیز آگار پلیت مشابه روز قبل تهیه کنید که دارای دو آنتی بیوتیک آمپلی سیلین و تتراسیکلین باشد (100μg /ml  آمپی سیلین و 12.5μg/ml تتراسیکلین )  و هر کلنی  را در خانه هم شماره آن روی پلیت حاوی تتراسیکلین  و آمپی سیلین کشت دهید

5- روز بعد هر کدام از کلنی  ها که رشد نکرد ه باشند   حاکی  از حساس  بود ن آنها به تتراسیکلین میباشد (قطعه  DNA  مورد نظردر پلاسمید کلون شده است).

6-  کلنی باکتری که رشد نکرده را از روی Master plate  شماره 1 ( بدون تتراسیکلین ) پیدا کرده و از آن کشت شبانه تهیه کنید

پلاسمید آن را استخراج کرده و با آنزیم BamHI  آن را برش دهید ، بعد از الکتروفورز باید قطعه DNA  کلون شده را روی ژل مشاهده کنید ( تقریبا" 800bp  میباشد ) .

 

ب) غیر فعال کردن  ژن LacZ` پلاسمید Bluescript  و مشاهده کلنی ها ی آبی و سفید

( alfa- complementation test ) همانطور که قبلا" گفته شد MCS پلاسمید Bluescript داخل  ژن LacZ` تعبیه شده است . سکانس این ژن  قسمتی ازسکانس  ژن آنزیم β-galactosidase است , این آنزیم اثصالات بتا گالاکتوزیدی لاکتوز را تجزیه کرده و لاکتوز را به گلوکز و گالاکتوز تبدیل میکند , همچنین   ماده X-gal  را که آنالوگ لاکتوز میباشد تجزیه کرده و رنگ آبی تولید میکند. سلولی (باکتری) که آنزیم بتا گالاکتوزیداز آن ناقص باشد یعنی ژن قطعه LacZ` را نداشته باشد چنانچه با پلاسمیدی که سکانس ژن LacZ`  داشته باشد ترانسفرم گردد آنزیم بتا گالاکتوزیداز آن کامل میشود و میتواند لاکتوز یا X-galرا تجزیه کند.  چنانچهinsert DNA  درMCS این پلاسمید کلون شود ژن مذکور غیر فعال شده و باکتری نمیتواند بعد ترانسفرم شدن با پلاسمید  X-gal  را تجزیه کند در نتیجه رنگ آبی تولید نمیشود و کلنی های بیرنگ تولید میشود.

شکل  شماره : 6مراحل غربالگری کلنی های حاوی پلاسمید pBR322 نوترکیب از طریق غیر فعال کردن ژن مقاومت به تترا سیکلین .

 شکل شماره 7- اپرون lac . ژنهای ساختمانی lacZ, lacY, lacA که به ترتیب آنزیمهای ترانس استیلاز، لاکتوز پرمئاز وبتا گالاکتوزیداز را کد میکنند( Z,Y,A) . این ژنها توسط پروموتور (P) و اپراتور (O)کنترل میشوند. اپراتور جایگاه اتصال پروتئین رپرسور است و ژن lac آنرا کد میکند . ژن رپرسور توسط پروموتور (P) خودش کنترل میشود

 

 

شکل شماره 8- ساختمان X-gal  و تاثیر آنزیم  β-galactosidase روی آن. این آنزیم X-gal را به  گالاکتوز ومشتق ایندوکسیل( indoxyl)  تجزیه میکند، سپس ایندوکسیل اکسیده شده و به دی دی برومو-کلرو تبدیل میشود که رنگ آن آبی میباشد

 

 

 

شکل شماره 9- روش غیر فعال کردن آنزیم بتا گالاکتوزیداز:

 A) در سیستم alfa-complementation test.  کروموزوم باکتری  ژن lacZ ناقص دارد و قسمت N ترمینال(alfa peptide) ژنβ-galactosidase راکد نمیکند و محصول ژن فاقداین قسمت میباشد . ژن lacZ`   پلاسمید در داخل باکتری  قسمت  alfa peptide  را کد میکند و ژن بتا گالاکنوزیداز فانکشنال  تولید میشود که در حضور X- gal  رنگ کلنی های باکتری آبی میشود . (b یک قطعه DNA  در پلاسمید کلون شده  ,ژن  lacZ` ناقص شده است  ونمیتواندX-gal   راتجزیه کند در نتیجه کلنی  های باکتری  سفید میگردند.

 

1-  DNA  را در جایگاه آنزیم  BamHI یا EcoRI پلاسمید Bluescipt  کلون ( Ligate   ) کنید.

2-  واکنش  Ligation  را داخل باکتری XL1- blue ترانسفرم کنید ( ژنآنزیم  β-galactosidase این باکتری ناقص است و همراه ژن LacZ` پلاسمید  Bluescript  کامل میشود اما ژن آنزیم بتا گالاکتوزیداز باکتری HB101   کامل است وبرای این منظور قابل استفاده نمیباشد )

3-  باکتری ترانسفرم شده را روی آگار پلیت حاوی X-gal  و IPTG پخش کنید ( IPTG یک ماده القاء کننده پروموتور ژن است و موجب بیان  آنزیم β-galactosidase میشود ) .

4-  قبل از پخش کردن واکنش روی پلیت , به هرکدام مقدار 40 میکرولیتر از  20 mM X- gal   و 4 میکرولیتر از  200 mg/ml IPTG  اضافه کنید.

5-  روز بعد ( 16-12 ساعت ) کلنی های آبی و سفید روی پلیت آگاررشد میکنند که کلنی های سفید حاوی Recombinsnt plasmid میباشند

توجه : اگر پلیت حاوی X- gal و IPTG را چند ساعت در 4 درجه قرار دهید رنگ آبی بخوبی ظاهر میشود. مرکز کلنی حاوی ژن بتا گالاکتوزیداز آبی کم رنگ و محیط آن آبی پررنگ است.  در مرکز کلنی های سفید نقطه آبی  خیلی  کم رنگ دیده میشود ولی محیط آنها بیرنگ است.

کلنی   های سفید راکشت دهید و پلاسمید آنهارااستخراج کنید. پلاسمید را با آنزیم BamHI هضم کنید باید بعد از الکتروفورز قطعه DNA  کلون شده را روی ژل مشاهده کنید