پلاسمید ها :

پلاسمید یک مولکول dsDNA   حلقوی  است که  وارد باکتری میشود و همانند سازی آن داخل سیتوپلاسم باکتری وبطورمستقل از ژنوم باکتری انجام میگیردوبه آسانی هم از باکتری استخراج میشود.  هرپلاسمید دارای یک(ori)      Origin of Replication  ( منشاء همانند سازی ) است که همانند سازی  پلاسمید از آن نقطه شروع میشود . قسمتی از ترادف پلاسمید که برای تعدادی از Restriction enzyme ها فقط یک جایگاه برش دارد و این آنزیم ها در قسمتهای دیگرترادف پلاسمید جایگاه برش ندارند  Multiple Cloning Site   گفته میشود  وبرای  تهیه  Recombinant DNA  از آن استفاده میشود یعنی  مولکول DNA خارجی در این قسمت کلون ( Clone )   میگردد.تعدادی از پلاسمید ها در طبیعت یافت میشوند (در باکتریها و مخمرها ) ولی در مقایسه با کروموزوم سلول میزبان بسیار کوچکتر  می باشند و اغلب در خارج کروموزوم باکتری دیده میشوند.( تعدادی از پلاسمید ها برای کارهای خاصی در آزمایشگاه طراحی و ساخته شده اند ).  اگر چه پلاسمیدها برای زندگی سلول باکتری ضروری نیستند ولی حاوی ژن مقاومت  به یک آنتی بیوتیک میباشند که برای کارهای مهندسی ژنتیک لازم و ضروری است. بعضی از پلاسمیدها تعداد زیادی کپی در داخل سلول باکتری دارند که بنام High copy number plasmid  گفته میشوند(همانند سازی  این پلاسمید ها به کروموزوم  باکتری بستگی ندارد) و Relaxed Plasmid هم گفته میشوند . تعداد دیگری ازپلاسمیدها تعداد کپی محدود تری در داخل سلول باکتری ایجاد میکنند که بنام Low copy number plasmid معروف هستند و باکتری شدیدا" Replication آنها را کنترل میکند و به Stringent Plasmid هم معروف میباشند.  با تغییراتی که در Sequence  پلاسمید ها ایجاد میکنند صفات خاصی در آنها بوجود می آید که در مهندسی ژننتیک استفاده میشوند .چنانچه ori دو پلاسمید  از یک منشا باشند هنگام ترانسفورماسیون با هم رقابت کرده و فقط یکی از آنها وارد باکتری میشود اما اگر منشا  ori  انها با هم اختلاف داشته باشد هنگام ترانسفور ماسیون  دو پلاسمید نیز میتوانند وارد یک سلول بشوند ( این مسئله در کارهای کلونینگ اهمیت خاصی دارد ).

کارهای عملی در این کار گاههای آموزشی با دو پلاسمید انجام میگیرد:

الف) پلاسمید pBR322  این پلاسمید توسط فرانسیسکو بولیوار و همکاران طراحی و ساخته شده است و همه خصوصیات یک پلاسمید خوب را دارا میباشد . وزن مولکولی پایین (4363bp ) دارد و برای تعدادی از Restiction Enzyme  ها فقط یک جایگاه برش دارد . این پلاسمید دارای دوژن مقاومت به آمپی سیلین و تترا سیکلین  میباشد و هنگامیکه وارد باکتری میشود باکتری نسبت به دو آنتی بیوتیک  مذکور مقاوم میشود.قسمتی از ترادف این پلاسمید  (705bp ) را که برای ادامه زندگی آن ضروری نمیباشد  با آنزیم HaeII برش داده و حذف کرده اند واز آن  پلاسمیدی بنام pT153 ساخته  اند که همانند سازی آن 5-3 برابر پلاسمید PBR322  میباشد .

ب) پلاسمید Bluescript sk  همانطور که در شکل دیده میشود ترادف ژن Lacz` ( قسمتN terminal  ژن β-galactosidase ) بطوری روی پلاسمید  تعبیه شده است که Multiple Cloning Site این پلاسمید قسمتی از ترادف ژن مذکور میباشد. (جایگاه برش آنزیمها درقسمت های مختلف ترادف پلاسمید PBR322 قرار دارند ) که  درمهندسی ژنتیک برای انتخاب کلنی های سفید باکتریایی حاوی  Recombinant DNA استفاده میشود.  در دو طرف MCS   این پلاسمید پروموتور فاژهای  T3 و T7 قرار داشته که  ژن کلون شده  را بر حسب Orientation  آن میتوان توسط هر یک از پروموتورهای  مذکور بیان ( Express) نمود .

 

 این پلاسمید دارای دو Original of Replication  است که یکی از باکتری E.coli  و دیگری از فاژ F1 گرفته شده است که به این علت فاژمید هم گفته میشود.. این پلاسمید برای تولید ssDNA    هنگام  Sequencing  یک قطعه  DNA هم قابل استفاده میباشد.  در Bluescript sk (M13) جایگاه آنزیم SacI بلافاصله در Downstream پروموتور فاژ T7 و جایگاه آنزیم KpnI بلافاصله در Downstream پروموتورفاژ T3 قراردارند. پلی کلونینگ سایت  Bluescript ks (M13))  در orientation مخالف  پلاسمید Bluescript sk (M13-)   قرار گرفته است.