برای تایید انجام کارهای مهندسی ژنتیک با ید تغییراتی که روی  DNA ایجاد  شده است  رویت گردند، مشاهده DNA  متعافب الکتروفورز روی ژل آگارز یا پلی آکریلامید و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید امکان پذیر خواهد بود. برای انتخاب درصد آگارز از جدول شماره 2  استفاده میشود:

 

جدول شماره 2 - قدرت جداسازی مولکولهای DNA  توسط غلظتهای مختلف آگارز

درصد آگارز

قدرت جداسازی DNA

3

100-1000bp

2

200- 1500bp

1.5

300- 3000bp

1

500 – 5000bp

0.8

1000- 7000bp

0.6

10 – 30kbp

0.4

30 – 50kbp

 

12- تهیه  ژل  آگارز

1-  قالب ژل را آماده کنید

2- شانه ای با دنده های مناسب روی قالب قراردهید

3- حجم ژل مورد نظر را تعیین کنید ( اندازه گیری طول وعرض قالب و قطر ژل مورد نظر )

4- پودر آگارز را وزن کنید

5- آگارز را در بافر 1xTBE حل کنید و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنک شدن به ازای هر 10 میلی لیترژل  یک میکرولیتر از محلول   10mg/ml  اتیدیوم بروماید اضافه کنید  سپس آن را خوب مخلوط کرده و داخل قالب بریزید

1xTBE= 89mM Tris base, pH8, 89mM boric acid, 2.5mM EDTA, pH8

6- بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج کرده و داخل تانک الکتروفورز قرار دهید

7- هر 5 میکرولیترنمونه را با یک میکرولیتر بافر نمونه مخلوط کرده و داخل چاهک های ژل بریزید (این بافر حاوی 50درصد ماده سنگین کننده مانند گلیسرین یا ساکارز است که نمونه بخوبی داخل چاهک  ریخته میشود  و همچنین حاوی0.2 درصد از یک رنگ نشانه مانند بروموفنل بلو یا گزیلن سیانول میباشد . رنگ برومو فنل بلودر ژل 1.5 درصد همراه با  500bp  و درژل 0.8 درصد با 1000bpحرکت میکند )

جدول شماره 3 :  مقایسه حرکت رنگ نشانه و مارکر DNA   روی ژل آگارز

درصد ژل آگارز

حرکت  تقریبی رنگ نشانه در مقایسه با مارکر

حرکت تقریبی  DNA   در مقایسه با مارکر

برومو فنل بلو

Xylen cyanol

0.4

500bp

3 kbp

2.5 kbp

0.8

500 bp

3 kbp

1kbp

1

500bp

3 kbp

500 bp

1.25

500 bp

3 kbp

250bp

1.5

100bp

1kbp

250bp

2

100bp

1kbp

100bp

 

جدول شماره 4 :  مقایسه حرکت رنگ نشانه و مارکر DNA   روی ژل  پلی آکریلا مید

درصد ژل پلی آکریلامید

حرکت  تقریبی رنگ نشانه  در مقایسه با مارکر

حرکت تقریبی  DNA  در مقایسه با مارکر

برومو فنل بلو

Xylen cyanol

3.5

100bp

500 bp

100 bp

5

75bp

250bp

75bp

8

50bp

250bp

50 bp

12

25bp

75bp

25bp

15

10bp

60bp

25bp

20

10bp

60bp

5bp

 

8.- بافر تانک باید کاملا" روی  ژل  را بپوشاند و نمونه ها از داخل بافردرون چاهک ها ریخته شوند. (از بافرهای مختلف استفاده میگردد.   بهتر است هنگام الکتروفورز به ازای هر میلی لیتر بافر تانک  (TBE buffer) یک میکرو لیتر از اتیدیوم بروماید 10mg/ml  اضافه شود.

9- DNA دارای شارژ منفی است و برای الکتروفورز شدن باید  نمونه بطرف قطب منفی با شد  تا هنگام الکترو فورز به سمت قطب مثبت حرکت کند

10- تانک الکتروفورز را به منبع تغذیه وصل کنید

11-  پیچ Current را روی ماکزیمم قرار داده و ولتاژ را تنظیم کنید (10V/centimetr )

وقتی رنگ نشانه سه چهارم طول ژل را طی کرد ژل را از تانک خارج کرده بانورUV نتیجه را مشاهده کنید .

 

 

13- تهیه ژل پلی آکریلامید :

قدرت تفکیک سازی این ژل بسیار بالا است و قطعات DNA  با طول کم نیز در این ژل قابل رویت میباشند و بسته به در صد ژل حتی اختلاف یک باز را میتوان در قطعات DNA  الکتروفورز شده مشاهده نمود .

1. شیشه ها، شانه ( Comb )  و فضاسازها ( Spacer)   را با آب و دترژان خوب بشویید و سپس با الکل 70 در صد آنهارا تمیز کنید تا چربی دستها روی آنها باقی نماند ( بجای پنبه  از گاز استفاده کنید زیرا پرزهای پنبه روی شیشه باقی میمانند ) .

2. قالب ژل را آماده کرده و جهت جلوگیری از نشت ژل ازداخل آن اطراف آن را با آگارز 1در صد به دقت درز گیری   (Seal)  نمایید .

3. حجم قالب (cast ) را  ( حجم ژل) با اندازه گیری طول وعرض قالب مشخص نمایید ( قطر ژل بسته به قطر فضا سازها یک و یا نیم میلیمتر است )

4. بسته به در صدژل مورد نظر مقدار آکریلامید و بیس آکریلامید لازم  را (بصورت مخلوط 29  در صد آکریلامید و 1درصد بیس آکریلامید تهیه و در یحچال نگهداری میشود) داخل لوله تمیز بریزید

5. از بافر 10xTBE  با غلظت نهایی 1x  اضافه کنید وبا آب مقطر به حجم مورد نظر برسانید

6. مقدار 100 میکرو لیتر آمونیوم پرسولفات 10درصد و 3 میکرو لیتر محلول TEMED  به آن اضافه کنید ( توجه داشته باشید که مونومرهای  اکریلامید وبیس آکریلامید در حال پلیمریزه شدن هستند)

7. به آرامی  محلول را در قالب از قبل آماده شده بریزید و مراقب باشید که حباب هوا وارد آن نشود زیرا حباب هوا مانع انجام الکترو فورز میشود .

8. به آرامی شانه را داخل قالب قرار دهید تا بعد از پلیمریزه شده ژل ، درون آن چاهک هایی جهت نمونه گذاری ایجاد شود

9. بعد از پلیمریزه شده به آرامی شانه را درآورده و چاهک هارا با آب بشویید تا اگر مونومرهای پلیمریزه نشده هنوزوجود دارد شسته شوند

10. گیره پایینی   را باز کنید  وفضاساز پایینی   را از قالب خارج کنید

11. گیره های طرفین را باز کرده و دستگاه را طوری داخل تانک مخصوص قرار دهیدکه قسمت بریده شده  شیشه رویی  ( Notch )  به سمت محفظه بالایی (  تانک  فوقانی) قرار گیرد

12. شیشه های دستگاه ( قالب) را با نصب گیره ها ی مخصوص به طرفین تانک ,  ثابت نمایید

13. محفظه های بالا و پایین تانک را با  1xTBE buffer  پرنمایید بطوریکه بافر روی چاهک ها را بپوشاند. چنانچه بین  دوشیشه قالب ( محل خارج کردن فضاساز پایینی ) که در محفظه پایینی تانک قرار دارد حباب هوا مشاهده میشود با یک سرنگ پر از بافر که دار ای سر سوزن کج است حباب هوا را بیرون کنید تا مانع جریان الکتریکی نشود و الکترو فورز بخوبی انجام گیرد

14. محصول PCR  را ( همانند الکتروفورز با ژل آگارز)  با بافر نمونه گذاری مخلوط کرده و توسط سرنگ هامیلتون نمونه گذاری را روی ژل انجام دهید

15. محفظه بالایی تانک  را به قطب منفی ومحفظه پایینی  را به قطب مثبت منبع تغذیه وصل کرده و الکتروفورز کنید 

16. بعد ازخاتمه الکتروفورز ( وقتی رنگ نشانه به پایین ژل رسید) جریان برق را قطع کرده و شیشه را از تانک جدا کنید. با یک تیغه فلزی نازک به آرامی بین دو شیشه فشار آورید تا دو شیشه از هم جداشوند . ژل به یکی از دو شیشه می چسبد . به آرامی آنرا  داخل آب حاوی 10 میکروگرم درهرمیلی لیتر اتیدیوم بروماید قرار دهید تا بعد از چند دقیقه ژل رنگ شود .

ژل را روی دستگاه UV Transilluminator  قرار داده و نوارهای  های DNA  را مشاهده کنید.