اهداف

1- آشنایی با اهمیت بیماریهای ناشی از مواد غذایی .

2- تفکیک و تمایز باکتریهای عامل مسمویت غذایی و باکتریهای عامل عفونت غذایی از یکدیگر .

3- مقایسه کلی روشهای سنتی و روشهای جدید تشخیص و جداسازی باکتریهای بیماریزا در مواد غذایی .

4- شناخت مراحل مختلف جداسازی و تشخیص باکتریهای مواد غذایی در روشهای سنتی ( مراحل پیش غنی سازی – غنی سازی انتخابی – محیط جامد انتخابی ) .

5- شناخت نسبی روشهای جدید تشخیص و جداسازی باکتریهای بیماری زا مواد غذایی ( روشهای فیزیکی ، شیمیایی ، ایمونولوژیکی ، ژنتیکی ).

6- آشنایی با اصلاحات متداول در زمینه جداسازی و تشخیص باکتریها نظیر ( غنی سازی باکتریها ، محیطهای مورد استفاده ، اندازه گیری ایمپدانس ، فلوسیتومتری ، هیبریداسیون ELISA,DNA ، کواگلوتیناسیون لاتکس ، PCR و ... )
خلاصه

در طول سالهای گذشته ، بیماری های میکروبی ناشی از مواد غذایی، همواره یکی از عمده ترین بیماری های کشورهای مختلف جهان محسوب گردیده است .

این بیماریها که جزء بیماری های روده ای تقسیم بندی می گردند ، نه تنها در کشورهای در حال توسعه بلکه در کشورهای توسعه یافته با استاندارد بالای بهداشتی نیز رو به افزایش بوده اند . به عنوان مثال در ایالات متحده آمریکا از نطر اهمیت بعد از بیماریهای ریوی ، در مقام دوم قرار دارند .

در بین عوامل میکروبی ، باکتری های عام مسمویت مواد غذایی ( Food Bone Bacterial Intoxications )مطرح هستند که با تولید سم در ماده غذایی باعث بروز مسمویت می گردند . و گروه دوم تحت عنوان باکتریهای عامل عفونت مواد غذایی ( Food Borne Bacterial Infections ) مطرح بوده که با تکثیر خود و یا تولید متابولیت های خاص باعث بروز عفونت می گردند . با توجه به اینکه اکثر موارد عفونتها و مسمویتهای میکروبی توسط باکتریها انجام می گیرد ، تشخیص و جداسازی آنها حائز اهمیت فراوانی است .

امروزه علاوه بر روشهای سنتی ، تکنیک های جدیدی برای جداسازی و تشخیص باکتریهای بیماریزا در موارد غذایی مورد استفاده قرار می گیرند که از آن جمله می توان به روشهای ژنتیکی ( مثل تکنیک PCR ) ( Ploymerase Chain Reaction ) ، روشهای فیزیکی ( مثل اندازه گیری مقاومت الکتریکی و روش فلوسیتومتری ( Flow Cyomrtry ) ، روشهای شیمیایی ( مثل هیبریداسیون DNA ( DNA Probe ) و روشهای ایمونولوژیکی ( مثل کواگلوتیناسیون لاتکس ( Latex Coagglutination ) و تکنیک ELISA ( Enzyme Linked Immuonadsorbent Assay ) اشاره نمود .
مقدمه

میکروب شناسی موادغذایی یکی از شاخه های علم میکروبیولوژی است که کاربرد آن در صنایع غذایی و مراکز تحقیقاتی نیازمند افرادی است که آموزشهای لازم را دیده و از تجربه قابل توجهی برخوردار باشند و از سوی دیگر آزمایشگاه مناسبی را در اختیار داشته باشند . در این راستا روشهای جداسازی و تشخیص باکتریها بویژه باکتریهای بیماریزا در مواد غذایی که به دو روش کلی سنتی و مدرن انجام می گیرد ، حائز اهمیت فراوانی است . روشهای سنتی روشهایی هستند که غالباً وقت گیر بوده و علیرغم کم هزینه بودن همواره برای میکروبشناسان مشکل ساز هستند و خصوصاً هنگامی که اعلام سریع نتایج از نظر اقتصادی و پزشکی واجد اهمیت است ، این مشکل بیشتر احساس می گردد . به عنوان مثال در مورد بعضی از میکروبهای مهم بیماریزای موادغذایی ( نظیر سالمونلا ) نیاز به صرف چندین روز وقت به دلیل تهیه محیط های متعددی هستیم . خوشبختانه در روشهای جدید و سریع که امروزه برای تشخیص و جداسازی باکتریها مورد استفاده قرار می گیرند ، این مشکلات مرتفع گردیده و با تکنیکهای مبتنی بر روشهای فیزیکی ، شیمیایی ، ایمونولوژیکی و ژنتیکی میتوان در اسرع وقت نتایج را اعلام نمود .

روشهای جداسازی و تشخیص باکتریهای بیماری زایی در مواد غذایی

الف ) روشهای سنتی

در روشهای سنتی عموماً براساس کشت باکتری در محیطهای مختلف و تولید کلنی های قابل رویت در یک محیط جامد انتخابی و انجام آزمایشات بیوشیمیایی در محیطهای مایع است . با توجه به اینکه موادغذایی ، میکروبهای بیماری زا غالباً به مقدار نسبتاً کمی وجود داشته و توسط میکروبهای عامل فساد ، در موضع مغلوب قرار می گیرند و از سوی دیگر طی عملیات های فرآوری مواد غذایی دچار صدمه می گرداند ، در نتیجه جداسازی باکتری مورد نظر پیچیده تر بوده و زمان بیشتری را طلب می کند و به همین دلیل جداسازی آنها معمولاً در سه مرحله پیش غنی سازی ( Pre Enrichment ) ، غنی سازی ( Enrichment ) و کشت در محیط جامد انتخابی ( Selective Plating ) صورت می گیرد .

1- مرحله غنی سازی : این مرحله که به آن مرحله احیاء ( Resuscitation ) نیز گفته می شود ، برای حفظ تعداد کم باکتریها و التیام باکتریهای صدمه دیده در فرآیندهای مختلف ضروری به نظر می رسد و در مورد بعضی از میکروبهای بیماریزا نظیر سالمونلا استفاده از یک پیش غنی کننده ( مثل محیط لاکتوز براث Lactose Broth ) الزامی است . برای انجام این مرحله از یک محیط غیر انتخابی استفاده می گردد

2- مرحله غنی سازی : در مواقعی که تعداد باکتریهای بیماریزا در نمونه غذایی بسیار کم است ، غنی سازی انجام می گیرد . هدف از این مرحله رشد ارگانیسم مورد نظر بوده و لذا با استفاده از محیط غنی کننده مایع ، باکتریهایی که بالاترین ضریب رشد GrowthRate را در بین جمعیت میکروبی آن نمونه غذایی ، دارا باشند در این محیط رشد خواهند نمود . مثلاً در مورد سالمونلا از محیطهای سلنیت سیستینSelenit Cistine یا تتراتیوناتTetrationate استفاده می گردد. اکثر محیطهای غنی سازی از نظر مواد مغذی پیچیده بوده و شرایطی را فراهم می سازند که طی آن رشد میکروارگانیسمهای رقیب کاهش یابد ویا از رشد آنها جلوگیری شود و تنها باکتری مورد نظر رشد نماید . لازم به ذکر است در مورد بعضی از باکتریها نظیر یرسینا آنتروکولیتیک ( Yersinia Entrocolitica) و لیسریامنوسیتوژنز ( Listeria Moncytogenes) به علت سرما دوست بودن ، غنی سازی در سرما صورت می گیرد .

1- مرحله استفاده از محیطهای جامد انتخابی

محیطهای جامد انتخابی ، محیطهایی هستند که یک میکروب یا گروه خاصی از میکروبها را انتخاب می کنند . اصول ساخت این محیط ها مشابه محیطهای غنی کننده مایع است و در تهیه آنها از عوامل مورد نیاز برای رشد باکتری استفاده می گردد . بدین معنی که در تهیه آنها از موادی استفاده می شود که باعث می گردد میکروب مورد نظر در آن رشد کرده و از سایر میکروبها تفکیک داده می شود .

البته پیشنهاد می گردد حتی در مواردی که پرگنه های واضح و تیپیکی در این محیطها رشد کرده باشد ، بهتر است قبل از نتیجه گیری نهایی ، از آزمایشات تاییدی استفاده گردد . به عنوان مثال آزمایشات بیو شیمیایی ساده ای نظیر کاتالاز ( Catalase ) ، اکسیداز ( Oxidase ) ، کوآگولاز

( Coagulase ) و همچنین رنگ آمیزی گرم می توانند بسیار مفید واقع شوند .
ب ) روشهای جدید

در طی سالهای اخیر ، روشهای جدیدی به منظور جداسازی و تشخیص میکروبهای بیماریزا مواد غذایی مطرح گردیده اند که در مقایسه با روشهای سنتی ، دارای سرعت بسیار بالاتری در تشخیص عامل بیماری زا هستند . در جدول شماره ((1 )) تعدادی از این تکنیک ها معرفی گردیده اند .

1- روشهای فیزیکی :

از روشهای فیزیکی رایج می توان به دو روش زیر اشاره نمود :

الف ) اندازه گیری مقاومت الکتریکی ( Impedance Measurment )

این روش ، تکنیک نسبتاً سریعی است که توسط آن جداسازی باکتری براساس فعالیت متابولیکی و مقاومت الکتریکی که از خود نشان می دهد ، صورت می پذیرد . بدین صورت که باکتریهای موجود در نمونه ، با گذشت زمان از خود مقاومت الکتریکی نشان می دهند که میزان آن بر روی منحنی خاص نمایش داده می شود و اندازه گیری می گردد و از روی منحنی حاصله نوع باکتری و تعداد آن را تخمین می زنند . با استفاده از این روش جداسازی تعدادی از باکتری های بیماریزایی مواد غذایی مانند سالمونلا ، اشرشیاکولی ، استفیلوکوکوس آرئوس ( Staphylococcous Aureus ) و لیستریامنوسیتوژنز ، به طور موفق انجام گردیده است .
ب) فلوسیتومتری

منظور از این روش ، اندازه گیری تعدادی از سلولهای باکتری در یک محیط سوپانسیون ( مایع ) است که در آن سلولها بطور جداگانه توسط یک کانال جریانی ( Flow Cytometry Canal ) به طرف دتکتور ( Detector ) هدایت می شوند و دستگاه قادر است که هر سلول را از نظر ترکیبی و هویتی مشخص نماید ( براساس بازهای آلی آدنین ( Adenine ) ، تمیمین ( Thymine ) ، گوانین ( Guanine ) و سیتوزین ( Cytosine ) با استفاده از این روش باکتری لیستریا منوسیتوژنز در شیر مورد شناسایی قرار گرفته است.
2- روشهای شیمیایی

الف ) روشهای سنجش تولید ATP توسط باکتری ( ATP Assessment ) تعیین میزان ATP تولید شده توسط باکتری یکی از روشهایی است که در تعیین وضعیت بهداشتی مواد غذایی مورد استفاده قرار می گیرد و اساس آن واکنشی است که بین آنزیم لوسیفراز ( Luciferase ) صورت می گیرد . بدین صورت که آنزیم در حضور ATP تولید شده توسط باکتریها ، بر روی لوسیفرین اثر کرده و نور تولید می کند که میزان این نور تولید شده توسط دستگاه اندازه گیری می گردد . بدیهی است هر چه تعداد باکتری در نمونه مورد بررسی بیشتر باشد ، ATP بیشتری تولید گردید و نور بیشتری ایجاد می گردد .

ب ) روش هیبریداسیون DNA ( DNA Hybridization ) : این روش که به آن DNA Probe نیز اطلاق می گردد با استفاده از قطعات آماده و شناخته شده DNA ( پروب های آماده DNA ) انجام می گیرد و در واقع بین قطعه DNA معلوم و شناخته شده با قطعه DNA باکتری مجهول و ناشناخته یک نوع هیبریداسیون تکنیک عبارتند از :

1- نمونه مورد نظر را که حاوی باکتری است ، از یک فیلتر غشایی عبور می دهند تا باکتری روی این غشاء عبور می دهند تا باکتری روی این غشاء را پر کند .

2- DNA باکتری مورد نظر را جدا کرده و قسمتی از آن را روی فیلتر فیکس می نمایند . (DNA Probe باکتری ).

3- قطعه ای از DNA کارک داده شده را که می دانیم مربوط به چه نوع باکتری است (Probe آماده) به فیلتر اضافه می کنند تا توسط آن DNA باکتری مورد نظر را شناسایی کنند . بدین صورت که چنانچه قطعه DNA مارک داده شده با قطعه DNAباکتری مجهول جفت شوند و هیبرید تشکیل دهند، با شستشوی فیلتر از هم جدا نمی شوند و بر روی فیلتر باقی می مانند و بدین شکل باکتری مورد نظر شناسایی می گردد . مثلاً اگر پروب آماده ای از باکتری سالمونلا را به فیلتر اضافه کنیم ، چنانچه باکتری مورد بررسی نیز سالمونلا باشد ، قطعات DNA آنها با یکدیگر هیبرید تشکیل داده و جفت می شوند در حال حاضر این تکنیک به صورت کیت های تجاری خاصی جهت تشخیص باکتریهای سا لمونلا، کمپیلوباکترCampilobacter ژژونی ، و لیستریا مورد استفاده قرار می گیرد
3-روشهای ایمونولوژیکی

روشهای سرولوژیکی از سالها قبل به صورت اختصاصی در مواد غذایی مورد استفاده قرار گرفته اند لیکن به دلیل وجود واکنشهای کثبت کاذب که در این واکنشها رخ می دهد چندان مورد استقبال واقع نگردیدند . در سالهای اخیر با استفاده از تکنیک هایی نظیر پادتن های مونوکلونال Mono Coaglutination و کوآگلوتیناسیون لاتکسLatex Coaglutination و الیزااین مشکل مرتفع گردیده و امروزه کاربرد بسیارزیادی در تشخیص باکتریهای بیماریزا دارند
الف) روش کوآگلوتیناسیون لاتکس

روش ساده ای است که بر اساس آن مبتنی بر انجام واکنش بین پادتن و پادگن ( یا آنتی بادی و آنتی ژن ) است که توسط یک آنتی بادی مشخص شده ، آنتی ژن مورد نظر (باکتری یا توکسین ان) تشخیص داده می شود . امروزه در بازار ، پادتن های آماده که به لاتکس حساس شده اند Antibody Sensitised Latex به صورت تجارتی وجود دارد که نمونه آن کیست تجاری سالمونلا(پادتن ها آماده سالمونلا) است که برای جداسازی سالمونلادر نمونه های مواد غذایی مورد استفاده قرار می گیرد . یعنی در اثر واکنش بین پادتن حاوی لاتکس و آنتی ژن (باکتری یا توکسین باکتری ) آگلوتیناسیون ایجاد شده و باکتری تشخیص داده می شود

ب) روش ELISA

یکی از تکنیک هایی که به طور وسیع و گسترده ای برای جستجوی میکروبها در مواد غذایی مورد استفاده قرار می گیرد ، الیزا میباشد که اساس آن اتصال یک آنزیم به آنتی ژن یا بادی مورد نظر است .

مراحل کار عبارتند از: 1- باکتری یا توکسین مورد نظر(آنتی ژن ) روی یک فاز جامد قرار داده می شود (که این فاز جامد معمولاً پلی استیرن Poly Styrene است )

2- آنتی سرم اضافه می شود.

3-پادتن اختصاصی که حاوی آنزیم است اضافه می شود .( آنتی ایمونوگلوبولین )

4-شستشوی ملایم می دهند و میزان آنزیم باقیمانده در لوله یا حفره میکروتیتر Microtiter را اندازه گیری می کند تا مقدار مصرف آنزیم ، میزان پادتن های اختصاصی سرم اولیه مورد آزمایش قرار می گیرد .

قابل ذکر است آنزیمی که به طور معمول در این تکنیک مورد استفاده قرار می گیرد ، آنزیم هورس رادیش پراکسیداز (Horseradish Peroxidase ) است که مقدار آن را با اضافه کردن سوبسترای خاص پراکسیداز و به روش کالیمتری ( Colorimeter ) اندازه گیری می کنند .

نوعی از این تکنیک به نام ساندویج الیزا موسوم است که در آن پادتن جذب فاز جامد می شود و پس از شستشو محلول مورد آزمایش که حاوی آنتی ژن است اضافه می شود و مورد نظر حداقل باید دو موضع اتصال داشته باشد ) امروزه از این روش برای تشخیص استافیلوکوکوس آرئوس ، سالمونلا ، اشرشیاکولی و توکسین های آنها استفاده می گردد .

ج ) روش غنی سازی انتخابی حرکت ( Selective Motility Enrichment )

این روش که از آن برای تشخیص سریع سالمونلا استفاده می گردد و به آزمایش سریع سالمونلا ( Samonella Rapid Test ) نیز معروف است ، در واقع یک روش سرولوژیکی است که با غنی سازی باکتری توام است . یعنی ابتدا بایستی مراحل پیش غنی سازی باکتری ، غنی سازی انتخابی در محیط مایع و کشت در محیط جامد انتخابی صورت گرفته و سپس آزمایشات سرولوژیکی انجام گیرد . از آنجاییکه در این تکنینک ، حرکت سالمونلا مدنظر است ، تنها سالمونلاهای متحرک قابل جداسازی و تشخیص هستند و با توجه به اینکه اکثر سالمونلاها و به ویژه سالمونلاهای بیماریزای مواد غذایی متحرک هستند ، این روش سریع کاربرد بسیار زیادی دارد .
4- روشهای ژنتیکی

در طی سالهای اخیر روشهای ژنتیکی پیشرفت چشمگیری داشته ان دو به وفور در علوم بیولوژی و میکرو بیولوژی مورد استفاده قرار می گیرند . بعضی از این روشها عبارتند از تکنیک نمایش DNA پلاسمیدی ، تکنیک آنالیز DNA پلاسمیدی ، تکنیک آنالیز DNA باکتری توسط آنزیمهای اندونوکلئاز و تکنیک PCR .

تکنیک PCR ( ‍Polymerase Chaina Reaction ) : یکی از روشهای دقیق تشخیص باکتریهاست می باشد که منظور از آن پلیمریزاسیون و تکثیر و بزرگ سازی قسمتی از DNA باکتری است که با کمک پرایمرها ( Primers )صورت می گیرد .

مراحل کار عبارتند از :

1-قطعه ای از DNA باکتری مورد نظر را که باید بزرگ و تکثیر شود ، مشخص می کنند .

2-با کمک حرارت 95 درجه دو رشته DNA را از یگدیگر باز کرده و در واقع DNA باکتری را دناتوره می کنند .

3-با استفاده از دو پرایمر که به دو طرف این قطعه DNA متصل می شود و یک آنزیم مقاوم به حرارت به نام DNA پلیمراز ( Thermostable DNA Polymerase ) ، DNA باکتری را پلی مریزه و تکثیر می نمایند . ( این آنزیم از باکتری گرمادوستی به نام ترموفیلوس آکواتیکوس بدست می آید ) این تکنیک ، روشی سریع ، قدرتمند و بسیار مناسب جهت تشخیص وجود باکتری می باشد و حتی قادر است تعداد 10 سلول از یک باکتری را در یک نمونه 10 گرمی غذا ، مشخص نماید و از این رو یک روش بسیار ارزشمند محسوب می گردد .
نتیجه گیری

برای تشخیص و جداسازی باکتریها بویژه باکتریهای بیماریزا مواد غذایی به طور کلی دو نوع روش وجود دارد . روشهای سنتی که از سالیان دور مورد استفاده قرار گرفته اند و روشهای جدید که غالباً طی دهه اخیر مطرح گردیده اند . روشهای سنتی که غالباً در سه مرحله پیش غنی سازی ، غنی سازی و کشت در محیط جامد انتخابی انجام می گیرند ، حتی در مواردیکه در محیط انتخابی پرگنه واضح و تیپیکی تولید شده باشد بهتر است که بوسیله بعضی از آزمایشات بیوشیمیایی مورد تایید قرار گیرند ( آزمایشات ساده ای مثل کاتالاز ، اکسیداز ، کوآگولاز و رنگ آمیزی گرم اگر به درستی انجام گیرند کمک بسیار زیادی به فرد نموه و از اتلاف وقت جلوگیری می نمایند ) در مجموع روشهای سنتی اگر چه ارزش زیادی داشته و هزینه کمی را به همراه دارند لیکن جداسازی باکتریها با این روشها بسیار وقت گیر وز مان بر بوده و همواره برای محققین ، مشکلاتی را ایجاد می نمایند . این موضوع خصوصاً در مواقعی که با محدودیت زمانی مواجه هستیم و بایستی نتیجه را سریعاً اعلام نماییم اهمیت بیشتری پیدا می کند . روشهای جدید جداسازی و تشخیص باکتریهای بیماریزا ، برخلاف روشهای سنتی ، سرعت بسیار بیشتری دارند که علی رغم این برتری نیازمند آزمایشگاههای مجهز و افراد بسیار مجرب هستند و هزینه های بسیار زیادی را به همراه دارند . با توجه به پیشرفتهای اساسی و قابل توجهی که در این روشها صورت پذیرفته است به تدریج مشکلات مربوط به جداسازی و تشخیص باکتریهای مختلف مرتفع خواهند گردید . در بین روشهای جدید ، تکنیک های ELISA , PCR و هیبریداسیون DNA دارای کاربرد بیشتری می باشند